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硫配糖体

  异硫氰酸苯己酯对Molt一4细胞组卵白甲基化、乙酰化调控的测验斟酌 cHIA0Jen—wei uu De-10ng 【摘要】 主意斟酌异硫氰酸苯己酯(PHI)正在体外对淋巴细胞白札病Molt-4细胞系的效力,观 察PHI对Molt_4细胞组卵白甲基化、乙酰化调控的影响。设施采用Mrr法、克隆控制测验瞻仰PHl 对M01t-4细胞增殖的影响;采用流式细胞术检测PHI诱导细胞捌亡和埘细胞周期的影响;用westel b10t法瞻仰PHI效力后细胞的组卵白乙酰化酶、组卵白甲基化及乙酰化形态的蜕变。结果PHI可上 调M0lt4细胞组卵白乙酰化酶}弓00/cBP水准,明显降低组卵白113、H4乙酰化及H3K4甲基化水准, 控制组卵白甲基化113K9外达,阻滞细胞于c。/G.期,并诱导细胞凋亡。结论PHI或许是一种组蛋 白上乙酰化酶控制剂.同时能调控组蟹白甲基化,影响其外观遗传学,或许动作新的抗白血病调整药 【枢纽词】异硫氰酸苯己酯;组卵白去乙酰化酶控制剂;组卵白甲基化;外观遗传学Experhnent study hist叫emethylanon aIId acetyIa廿on jn Mo-4 ceus 【Abstract】obje础ve To investig舭the effect 0f phenylh8xyl山L11io。yaIlate(Pm)on acetyl ation rr地thylation0f histone 1n acute lymphoblaslic 1e1】kemia cdl line Molt4.Metho出 The jnhihitlon 0f ceU pr。ld岛atlon M’ITImetllod cl呲s“ppressiontest. ^poptosisand cell oy。le afrest were measured by玎ow oytometry The出Ie阻Iions i11 histone acetyInnsferase acetylallonsaIld methyl ations 0f histones were deteukd wenemb10t.ResuJts PHJ could“p—regulate山e expression甜acetyltransfer龃se (P300/CBP),markedly indd血e accumulanod acetylatedhi宴tone H3,H4粕d methyl日ted 11istone H3 ly鲥ne 4(mK4),aHd ihlbited methyla£10n lysine9“H3(H3K9).Tlm epi舻netic regLIlafion嘲u】ted In cell。”lc删t Go/GlphaSe,卸d lnduchon。f叩叩tosis Co眦lusi0璐 PHI can modulale b(,th hlstone me山ylaLlon acetvlation.Ttmay 8erve ahls的Iledeacetylase inhibitor,aud might 8po【entjalnovel anti—Ieukemia 89ent 【Key words】 Phe“ylhexy】isnthiocy8nat8; His山肿deacetylase inhibit07; Histonem甜1ylatio“; Epigenetlcs 异硫氰酸苯己酯(PHl)是人工合成的异硫氰酸 衍生物,异硫氰酸以硫配糖体的方式普及存正在于各 种十字花科植物中,如茎椰莱、甘蓝和水芥兰等。 Pm对众种实体肿瘤具有普及的控制效力,其效力 机制或许是通过控制某些肿瘤细胞发展所一定的酶 如细胞色素氧化酶P_450,或者诱导二相解毒酶 GsT、NADPH、uDPG的活性来阐明抑癌效力”o。我 们前期的事情仍旧声明PHI可动作去乙酰化酶抑 制剂(HDACi)控制组卵白去乙酰化酶(HDAc) 作家单元:363000福修医科凡学附庸漳州市病院血液科(黄 ar【唧t0f Med川他,New York M。dlcd c。i189e,V缸h越la,NY,刚s【a如(cmA0 jen wei、Llu De—l。“g) 通讯作家:马旭东,Emall:咖IJdnn枷5@hotItl“【m 论著活性及其卵白的外达,并凋控HL_60细胞的组卵白 乙酰化及甲基化,诱导HL-60细胞凋亡%。本测验 中咱们以淋巴细胞白血病M0lt4细胞系为模子,研 究PHI诱导Molt4细胞凋亡及其机制,为淋巴细胞 白『|i【病干扰调整供给新的思绪。 质料和设施 一、药物 PHI购自美邦LKT L汕oratories公司,以75%甲 醇配成5 mmoL浓度存储液,对比组应用75%甲 二、质料细胞教育JLf=『RPMl 1640为美邦Gibco公司产 万方数据 品,胎牛血清为杭州四序青生物成品公司产物,An—nex抽V和Pl双染试剂盒、细胞周期阐述试剂盒为 美邦BD公司产物,辣根过氧化物酶标帜的羊抗兔 二抗、westem blot化学发光事情液为美邦santa cmz公司产物,抗组卵白乙酰化H3、H4抗体、抗组 卵白甲基化H3K4、H3K9抗体、抗P300/cBP抗体为 美邦upsate公司产物。 三、设施 1.细胞教育:MoIt_4细胞购自武汉大学外率物 教育核心,用含10%胎牛血清的RPMI 1640教育液 置37、饱和湿度、5%c0:教育箱教育,隔天换液 传代,测验取对数发展期细胞。 2.PHI对Molt_4细胞增殖的影响:取对数发展 期细胞,将其密度调至1.0103/ml,接种于96孔细 胞教育板,每fLl()0l,测验组判袂加人PHI使终浓 度为O、5、10、20、40“moL/L,每组设6个半行孔,培 养24、48、72、96 h后,每孔到场M7rr(5 m苷/m1)lO 山,不停教育4 h,离心后小心吸去上清,每孔加100 山二甲基亚砜(sigma公司产物),充溢震撼混匀, 正在F“_2100酶标仪卜(美邦stat公司产物)测波长 492 nm和630 nm处吸光度(A)值,筹算细胞增殖 率。测验反复3次。 细胞增殖率(%):争堕虹二譬旦旦100% 3.PHI对M。lt4细胞克隆的影响:取对数发展期细胞按200细胞/孔接种于24孔细胞教育板,每 组设3个平行孔,教育编制为l ml,教育液为含 20%胎牛血清、0 8%甲基纤维素的RPMI 1640教育 液,到场PIII使终浓度判袂为0、5、20、40仙moL/L, 教育至10 d,筹算克隆数,以40个细胞为一个克 隆。取各测验组的均匀值,筹算克隆造成百分率,实 验反复3次。 4.PHI对Molt_4细胞凋亡的影响:将细胞用含 lO%胎牛血清的RPMI 1640教育液接种于75 znl培 养瓶,每瓶接种2106细胞,细胞密度为2105/ ml,到场PHI使终浓度判袂为o、5、20、40斗moL/L, 效力3、7、14 h搜求细胞。依据Annexin V和PI双 染试剂盒仿单管理后,登时行流式细胞术检测。 5.PHl对Molt4细胞周期的影响:细胞接种密 度及管理同前,搜求细胞,按cycle Test DNA试剂盒 仿单管理后,登时行流式细胞术榆测。 6.PHI对M01t4细胞组卵白甲基化、乙酰化状 态及凋亡合连卵白的影响:细胞接种密度及管理同 前,搜求细胞后,预冷0.66 mmL/L PBs洗涤2次,吸 干洗涤液。按每llo。细胞到场100山裂解液和 1“酶控制剂(美邦HERcE公司产物)的比例到场 裂解液和酶控制剂,冰上裂解细胞30 min,41000 r/min离心lo min,接收中央清亮层。bradfjrd法进 行卵白定量。以100 g/L或120 g/L的sI)s—PAGE 阐述,半干电迁徙法转膜,室温下摇床封锁1 h,到场 差异浓度的-抗,4歇宿,TBs洗涤液洗膜后判袂 放入用TBs按I:1000稀释的辣根过氧化物酶标帜 h,TBs洗涤液洗膜后化学发光法显色,x射线底片曝光,以B—tin为内 参照。 7.统计学管理:采用sPssll.5统计管理软件 阐述。旧例实行方差齐性查验,正态性查验。计量 原料测验数据以is显露。众组原料之间的斗劲 采片j单要素方差阐述;方差不齐采用非参数查验。 结果1.PHI对Molt4细胞增殖的控制效力:经差异 浓度PHI效力后,Molt_4细胞的增殖率随药物浓度 的添补及效力时问的拉长而渐渐r降,涌现为清楚 的浓度和时问依赖性,48 h时圮,。值为20“moL/L。 克隆造成测验解说,PHI能控制Moh_4细胞克隆形 成,不I司浓度的PHT管理组,克隆造成率均低于对 照组,0、5、20、40斗mo】/L PHI管理组克隆造成率依 次为(32.52.2)%、(17.41.3)%、(7.5 1.4)%、(1.31.0)%,分别有统计学事理(P< 005)。 2.PHI对M0lt_4细胞凋亡的影响:采用Ann“一 V和PI双染试剂盒通过流式细胞术定量阐述PHI效力于Mo】t4细胞3、7、14 h后细胞早期凋亡 率,结果显示PHI能诱导Molt_4细胞凋亡,并具有 功夫和剂量依赖性(外1)。 不|一j浓艘PHI效力不功夫对Molt-4细胞早期凋产的影响(%,ij) PHI浓度样本 (“moVT.)数 效力小同功夫细胞凋亡率 l320 22 23l0 4l 2650 37 llJ0 16 287O 36 402O 24 0520 40 】560 34 4310 15 5010 27 泣:过程单要素方差阐述,随地理组与对比组([’山nol/L)斗劲 05万方数据 3.P川对M01t4细胞周期的影响:Molt4细胞经O、5、20、40斗m01/L PHI管理7 h后,Go/G1期的 细胞比例遍地理浓度添补而添补,判袂为47.91%、 51.47%、63.89%、69.76%,s期的细胞却渐渐减 少,判袂为47.40%、47.30%、34.79%、28.04%,说 明PHI可使MolL_4细胞周_}}|j阻滞十晚/G.期。 4.PHI对组卵白H3、H4乙酰化形态及对组蛋 白乙酰化酶(HAT)的影响:Mol【_4细胞正在5、20、40 “m01/L PHI效力差异功夫,组卵白H3、}14乙酰化 水准清楚增高,旱现量效和时效干系。仅管理3 hH3、H4乙酰化水准即巩固,7 h后此蜕变趋向特别 明显,H3乙酰化水准判袂添补为对比组的】.02、 2.48、3.94倍,H4乙酰化水准添补为对比组的 1.03、2 43、3.89倍;PHI管理Moll4细胞后,HAT P300/cBP水准亦增高,均呈时效及量效干系(图 5.PHI对组卵白H3K4、mK9甲基化形态的影响:5、20、40 um01/1.PHI管理Molt_4细胞后H3K4 甲基化水准清楚增高,显露明屁的时效和量效蜕变, 3h后H3K4甲基化水准添补为对比的1.46、4.76、 4.6l倍;5、20、40批m彬L PHI管理Molt_4细胞3 h后对I{3K9甲基化形态影响不太清楚,然则管理7 h后H3K9甲基化水准消重为对比组的O,98、O.79、 0.68(图2)。 计划中心组卵白N终端受众种酶催化的翻译后修 饰,甲基化是中心组卵白N终端的点缀式样之一。 对组卵白甲基化的斟酌文献报道较少。甲基化位点 众位于H3、}14的赖氨酸和精氨酸残基i二,组卵白 H3巾的第9位赖氨酸(H3K9)和第4位赖氨酸 (H3K4)是组蛋[』甲基迁徙酶时时效力的位点”。。 近几年的斟酌解说,H3K9的甲基化与基因的重寂 相合,或许与HPl(1leterochromat—i”pmteins)或其同 源物相合。H3K9的甲基化可招募HPl或其同源物 Lj之贯串,从而使基因所正在部位异染色质化”1,对 于其详细历程Bird等”1提出过一个假说:起初组货 白脱乙酰酶使H3中的K9、K14脱乙酰化,然后 suv39hl或cl一对H3K9实行甲基化,H3K9的甲基 化再影响DNA的甲基化,随后甲基化的113K9动作 一个贯串位点招募HPl或Swi6蛋[J的定位,终末 HPl/swi6通过它们的染色质贯串区域定位正在c末 端,进『fii造成异染色质的众聚体。『f『iH3K4的甲基 1:omoL;2:5}Lm0I;3:20”mL;4:40“moL,L。a:效力3 h;h:效力7 h图1差异浓度P1II效力Mo】t4细胞小同时问后细胞m,IH乙酰化形态厦乙酰化酶的改动 pmovL.3:20…01/l-;4:40“ovL。a:效力3h;b:效力7}】 图2小同浓度PHl赴理M01t_4细胞差异时司舌组卵白H3K4、H3K9甲基化状惫的改动 万方数据 化与常染色质的造成相合”,zegeman等。“外明,H3K4的甲基化能控制哺乳动物中的具有控制基困 转录活性的HDAc复合物NuRD造成,这些都提示 H3K4的甲基化能间接地激活基冈的转录。本斟酌 结果显示PHI能使H3K9甲基化水准消重,而H3K4 的甲基化水准升高,并与PHI浓度和效力功夫有 荚。这些都与染色质重塑及激活基因转录相合。目 前斟酌未睹其他HDAa调整H3K9、H3K4的甲基 化形态的文献报道。Kondo等”o采用r TsA管理三 种肿瘤细胞,浮现TsA能控制组卵白脱乙酰化,但 对H3K9、H3K4的甲基化形态无影响,合连基因也 还是处于重寂形态。结果是PHl自己具有组卵白 甲基化酶的活性,照样通过其他途径激活或召募组 卵白甲基化酶来改动H3K9、H3K4的甲基化形态, 有待进一步斟酌。 组卵白乙酰化取得较为普及的斟酌,HAT能把 已酰辅酶A上的乙酰基迁徙到组卵白氨基终端赖 氨酸的s一氨基,中和组卵白的正电荷,使组卵白与 带负电荷的DNA磷酸骨架相排斥,转录复合物等更 易亲切DNA启动子区域,启动基因转录;HDAc能 脱乙酰基,使组卵白带上正电荷,控制转录”1。组 卵白乙酰化相当与众种肿瘤的发作、繁荣有亲切的 干系。HDAci能通过控制HI)Ac,上调合连基因的 转录,诱导肿瘤细胞凋亡或分解,惹起细胞周期的阻 滞,调控癌基因外达及抑癌基因活性,从而抵达调整 肿瘤的主意”…。本斟酌结果解说,PHI能明显降低 组卵白H3、}14的乙酰化的水准,PHI效力下Molt_4 细胞3 h后组卵白H3、H4乙酰化水准即清楚降低, 从而诱导细胞凋产和细胞周期阻滞,并町添补 P300/cBP的外达。咱们的前期事情声明了PHl通 过控制HDAc的活性及其外达而起效力;同时还证 明PHI对组卵白乙酰化水准调控的顶峰期是7~10 小叫,14小时后即降低…。 组卵白甲基化、乙腊化形态的改动可导致细胞 凋亡,并使细胞周期发作蜕变。咱们的结果提示 PHI可使细胞阻滞于q/G.期,提示PHI对M01t4 细胞周期的影响是阻滞细胞周期c,向DNA合成期 的s期过渡,G.一s期是细胞周期中最为紧张的检验 点(chcckpoint),合键受p21““””的调控o,前期 事情外明PHI能使组卵白H3乙酰化添补,并诱导 p2l”““”的启动f片断转录添补,阻滞HL-60细 胞周期于c。/G、期”J。故以为PHI对Molt_4细胞 周期的影响或许与PHI上凋p21““””‘的外达亲切 参考文献lao D,Snvasta、cL SK,I^w KL,et mAllyl is础locvanak,acon- 出tuent of证er0…cg咖hks,lIlhm;18 pmlikr址10nof hun】a”P阱 tacc1ls aena11d md唧g印optosis Cap gencsIs,2003,24:89l{97 2M:L X,Fa“g Y,Bekl曲u翻1eva A,ct缸Phe”yhe’yl…o洲o。p”a 1nhlMk blsIone deacat—aseand…011els chmm出on lndnc。gmwtha唧sI mhumml】#uk…ces Int JOnc01.2006.28:1287—1293 3Je州m T,Allls CD 200l,293 1074一1080 4Nakavaa BD,etdR0k h】stoneH3晡ne 9mc出一an蛐埘掣genen(_删,tlH'J he£b埘na£semMn&】…,2001,292:1lO一11 35Bl耐^.Me吐1订atlok het…‰toncand DNA Sclence 2001. 294 21130115 P,LmlPEplge”etlcrc刖1at Lon hlslo…nHhyLItl邮ldhlst……antsul Enfl…n01.2【105.19:563{73 7z。geP,c a【1as B,Pappm D,et dI…mly5lne 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