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类异戊二烯

  此中将代谢途径中的两个酶举办调解外达是最直接最常睹的手法。Zhou等[38]浮现,调解二萜合酶SmCPS和SmKSL,以及调解BTS1(GGPP合酶)和erg20(FPP合酶),可明显进步丹参酮二烯产量和消浸副产品的积蓄。将异戊二烯合酶(IspS)与IDI举办调解后,正在蓝藻中异戊二烯产量进步了3.3倍,摇瓶教育前提下达3.3mg/L[41]。Sarria等[15]将源泉于P. abies、A. grandis和P. taeda的GPPS和PS诀别举办卵白质调解,构修了9个卵白质调解,外达此中5个调解卵白可明显进步蒎烯产量,最高可进步52%。然而,将源泉于P. taeda的GPPS和PS举办调解后产量与共外达时比拟略有降落,这能够是由于卵白质调解影响了酶的空间构造进而使酶活消浸,故这一身手的利用往往控制于2~3个酶的调解。

  纵观近20年来萜类化合物正在微生物中的合成商酌,上述用于进步萜类化合物微生物合成产量的诸众战略中,筛选高活性的萜烯合酶虽至合主要,但往往筛选难度较大,且微生物自己内源前体合成通量很低,仅异源外达萜烯合酶举办出产远远餍足不了工业化需求。目前重要商酌就业集结正在改制微生物代谢途径以增添前体化合物的供应,这往往可有用进步萜类化合物产量。改制微生物代谢途径能够会变成代谢流的不均衡,于是需监控代谢途径中是否有中央产品的积蓄,通过调剂各卵白质的外达程度可有用均衡代谢通量,而调解外达合头酶最为常睹且方便易行,但控制于二酶的调解,生物支架手法可调剂众个酶的相对外达量,但操作较为杂乱于是利用较少。涉及采用分别启动子、RBS等组合战略调控众个酶的外达较为有用但就业量很大,动态调控的发扬仍有赖于生物传感器的浮现。上述各手法并不是统统独立的,商酌者往往会采用众种手法(如增添前体化合物产量并调解外达合头酶)对底盘微生物举办改制,以得到方针萜类化合物高产的平台菌株。

  基于对萜类代谢途径的了解,人们诈欺基因工程、代谢工程和合成生物学方式,通过微生物出产萜类化合物仍然获得了很大的提高,并正在医药、能源、生物资料等范围显露出了普遍的利用前景。最为告捷地是抗疟疾药物青蒿素的前体产品青蒿酸已正在酿酒酵母中实行生物合成,堪称该范围的里程碑[13],对应的萜烯紫穗槐二烯正在酵母中的产量高达40g/L[14],目前仍然实行了工业化出产。其他众种萜类化合物也已实行了正在微生物中的出产,但产量较低,如蒎烯也可正在大肠杆菌中合成,经由短短几年的商酌,产量已从5mg/L进步到了140mg/L[15-17]。但若要以蒎烯为原料实行高能化合物蒎烯二聚体的多量出产,而今产量远远达不到条件。若何进步萜类化合物的产量已成为而今各邦科学家眷注的热门。本文总结了近些年商酌者进步萜类化合物产量所用到的手法和战略,旨正在为萜类化合物正在微生物中的出产与商酌供应参考和鉴戒。

  目前重要通过改制和调控微生物内源代谢途径或者引入异源代谢途径来进步前体化合物的供应。

  除了改制微生物内源代谢途径外,目前最常用的战略是外达众个异源卵白或者全体引入异源代谢途径来增添IPP和DMAPP的供应量,如许做的好处是异源代谢途径不受细菌内源性调控,从而能够淘汰耗费。Martin等[36]初次将源泉于S. cerevisiae的MVA途径统统引入E.coli中,使最终紫穗槐二烯产量进步6.5倍,达112.2mg/L。

  除上述常用战略以外,又有良众可用于进步萜类化合物产量的手法。压抑角逐代谢途径是常用手法之一,如鲨烯合酶和紫穗槐二烯合酶角逐性地诈欺FPP,则可通过压抑鲨烯合酶的外达,进步紫穗槐二烯的产量[52]。微生物的教育历程及前提同样主要,因为个人萜类物质,如单萜对细胞有迫害效力,正在教育基上层参预有机相,可将有毒的萜类化合物萃取到有机相中,淘汰对细菌的迫害。比如,出产历程中参预邻苯二甲酸丁二酯行动溶剂后,柠檬烯的最小抑菌浓度与不加有机溶剂的体系比拟进步700倍(42g/L柠檬烯)[53]。行使分别宿主出产也会对方向化合物产量有影响,对付含氧的植物萜类,因为大肠杆菌外达植物P450单加氧酶的控制性,包罗缺乏电子通报链和跨膜区翻译不相容等,变成P450的活性较低,青蒿酸正在E.coli中的产量为105mg/L[54],而相应酵母青蒿酸产量高达25g/L[13]。于是,咱们需求遵照分别的出产需求及方针产品,选取适宜的底盘生物及适宜的战略。

  商酌者通过调剂合头酶基因外达程度,构修调解卵白、卵白质支架,以及采用动态调剂型启动子等手法来均衡代谢通量。

  进步萜烯合酶活性正在必然水平上可进步萜类化合物产量,但前体化合物IPP和DMAPP的供应同样主要。商酌剖明,大家半植物源泉的TPS的Kcat值较低,米氏常数Km值较高,往往正在μmol/L数目级,少数TPS的Km值以至正在mmol/L数目级,如异戊二烯合酶[20-22],这意味着异戊二烯合成速度吃紧依赖于前体化合物的浓度。基于质粒的E.coli外达体系比整合到基因组中的蓝藻外达体系具有更高的基因拷贝数,因此发生更众的IPP和DMAPP,毕竟剖明,E.coli中的异戊二烯产量远远高于蓝藻细胞的[22-23]。于是,合成高产量的萜类化合物一定要担保高通量的前体化合物IPP和DMAPP的供应。

  因为IPP和DMAPP是通过MVA途径或MEP途径来合成,外面上增添MVA途径或MEP途径的前体化合物的供应也能够进步IPP和DAMPP的产量。对付MVA途径,乙酰CoA是直接前体分子,Chen等[29]长远商酌了乙酰CoA正在酿酒酵母S. cerevisiae中的代谢历程,乙酰CoA正在细胞核、细胞质、线粒体和过氧化物酶体中均有发生,但只要细胞质中的乙酰CoA可用于合成萜类化合物,对此,商酌者提出了pull-push-block战略以进步细胞质中乙酰CoA含量,即过外达内源乙醇脱氢酶Adh2、乙醛脱氢酶Ald6,以及外达源泉于肠道僧人氏菌Salmonella enterica的乙酰CoA合酶的突变体[30],从而丙酮酸可有用地转化成乙酰CoA,最终使倍半萜烯紫穗槐二烯的产量获得了昭彰地进步[31]。正在此手法的根蒂上,敲除消费乙酰CoA的反响,如过氧化物酶体柠檬酸合酶Cit2或者细胞质内的苹果酸合酶MIs1,α-檀香萜烯产量达8.29mg/L,较原始菌株进步了4倍[30]。诈欺上述改制过的微生物出产由乙酰CoA衍生的产物,如正丁醇和聚β-羟基丁酸酯,其产量诀别进步到16.3mg/L和250mg/L,较原始菌株诀别进步6.5倍和18倍[32-33]。然而,以上手法吃紧依赖丙酮酸脱氢酶(PDH)旁途途径,该途径需求消费多量ATP。有商酌将乙酰CoA合成酶换成乙酰乙醛脱氢酶或丙酮酸甲酸裂解酶,消费较少的ATP,从而进步了萜类化合物产量[34]。对付MEP途径,前体分子是丙酮酸和3-磷酸甘油醛(G3P),两者的比例是影响依赖MEP途径的细胞出产萜类化合物的一个主要要素。丙酮酸更众地转化为G3P可进步番茄红素的产量[35]。

  涉及众个酶加入的代谢途径,各个酶的外达程度的均衡至合主要。商酌者通过均衡代谢途径上逛和下逛酶的外达程度告捷地进步了紫衫二烯和紫杉二烯-5α-醇的产量[24]。该手法以IPP和DMAPP为节点将紫衫二烯代谢途径分为两个模块,自然的上逛MEP途径中4个合头酶基因(dxs、ispd、ispF和idi)为一个模块,下逛萜烯造成途径中的GGPP合酶基因和紫衫二烯合酶基由于另一个模块。通过行使分别强弱的启动子及分别拷贝数质粒优化上逛和下逛基因外达程度,最终可得到1g/L的紫衫二烯,比优化进取步了15 000倍。该手法正在进步其他分别类型的产品量中也有利用,如丹参酮二烯[38]、脂肪酸[39]、松属素[40]。

  基于RNA的适配子或者转录因子可维系中央产品或终产品,通过感触代谢产品的浓度来正确调剂转录和翻译。目前一个基于自然代谢感触卵白的动态感触调控体系仍然用于出产脂肪酸衍生物和燃料[50]。该体系利用基于RNA的转录因子维系主要的中央代谢产品,通过感触代谢产品浓度来调剂转录和翻译,从而动态调控方针基因外达,将产量进步到外面产量的28%,同时还进步了菌株的褂讪性。

  生物传感器的利用正在动态调控细胞代谢途径中出现出浩瀚的潜力,但因为很众代谢物的感触器还未浮现,该手法正在进步萜类化合物合成方面的利用较少。Robert等[51]另辟门途,通过转录组学手法,浮现对积蓄的有毒代谢产品有相应的启动子,他们诈欺这些启动子来调控中央代谢产品FPP的出产,正在不成使诱导剂的状况下,对FPP的出产举办径态调控,将方针产品紫穗槐二烯的产量进步至1.6g/L。动态限定体系的发扬依赖于特别褂讪的遗传通途,以便遗传通途的性能正在菌种中更好地存储,同时条件传感和驱动的动态反响足够速,以便有用的相应代谢的变革。

  合成生物学和代谢工程的发扬促进了萜类化合物正在微生物中的出产,与萜类化合物联系的商酌功效也逐年递增。构造杂乱的萜类化合物,如紫杉二烯-5α-醇、青蒿酸等正在细菌或酵母细胞平台中的告捷合成,显示出微生物合成萜类化合物潜能。目前已浮现的领先55 000种萜类化合物中,能正在微生物中合成的只是冰山一角,很众萜类化合物合酶亟待开采。异源合成萜类化合物需求冲破细胞原有的杂乱代谢汇集,而咱们对若何仍旧细胞内的代谢均衡,若何调控新的代谢汇集以抵达最优产量知之甚少,这是目前束缚萜类化合物产量的一个很主要的情由。其它,少少主要萜类化合物前体物正在微生物中产量虽高,如紫杉醇和青蒿素,但其下逛终产品产量仍旧较低以至无法合成,此中的情由和联系机制仍需求长远商酌。联系身手和手法的发扬,必将煽动出产萜类化合物的细胞工场的发扬。

  增添前体化合物供应的一个战略是改制和调控微生物内源代谢途径,进步限速酶的外达量。对付MVA途径,已浮现羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)是限速酶,Keasling团队正在酵母中过外达截短的tHMGR使紫穗槐二烯产量进步了近5倍[8]。

  萜烯合酶(terpene synthase,TPS)的活性是萜类化合物生物合成历程中非凡主要的一个要素。分别物种源泉的萜烯合酶正在底盘微生物中涌现出分别的活性。Sarria等[15]正在大肠杆菌平分别外达了源泉于3种分别物种(A. grandis、P. abies、P.taeda)的蒎烯合酶基因,此中源泉于A. grandis的蒎烯活性最高,对应的蒎烯产量也最高。Beekwilder等[18]浮现了一种新的源泉于C. nootkatensis的瓦伦烯合酶CnVS,将瓦伦烯合酶Citru VS正在分别的微生物中举办异源外达,并与常睹的瓦伦烯合酶Citru VS的活性举办比力,浮现正在光合细菌Rhodobacter sphaeroides中异源外达CnVS,瓦伦烯产量比外达Citru VS进步了20众倍,未经由通途优化的光合细菌中产量由2.5mg/L进步到57.5mg/L,异源外达MEV途径时产量由24.9mg/L进步到352mg/L。正在未经由通途优化的Saccharomyces cerevisiae中异源外达CnVS,瓦伦烯产量达1.36mg/L,而外达Citru VS时,瓦伦烯产量仅为2μg/L。由此可睹,得到高活性的萜烯合酶能够极大进步萜类化合物的产量。

  受自然代谢通途中常睹的共区域化形象的发动,商酌职员试验用百般手法将异源酶系正在胞内密集,以进步酶以及联系代谢物的限度浓度,从而进一步进步方针产品的产量,淘汰代谢体例的串扰。

  固然外达异源代谢途径可有用进步前体化合物量,但因为微生物缺乏对异源代谢途径的调控,能够惹起代谢通量的不均衡,积蓄对细胞有迫害的中央产品,由此带来少少负面影响。正在大肠杆菌中异源外达MVA途径,中央产品3-羟-3-甲戊二酰辅酶A(HMG-CoA)积蓄后对细胞发生迫害效力,压抑细菌滋长,当过外达tHMGR后,HMG-CoA消费速度增添,细菌滋长速度规复到与野生型细菌相当程度[37]。由此可睹,要进一步进步萜类化合物产量,还需调剂各基因外达程度以均衡代谢通量。

  对付MEP途径,DXS、DXR、IDI被以为是该途径的限速酶,正在过去的十几年里,商酌者通过过外达DXS、DXR或IDI等限速酶基因,告捷进步了代谢前体化合物量,进而进步了方向产品产量[24-26]。比如,Matthew和Wurtzed[27]正在大肠杆菌中过外达DXS,使类胡萝卜素产量进步了10.8倍。行使众拷贝质粒来过外达限速酶基因往往对细菌发生代谢掌管,且质粒不褂讪,容易遗失,而对基因组中基因举办直接调控则可避免这些题目。Yuan等[28]将染色体中DXP途径联系基因的自然启动子换成强启动子T5,构修了工程菌E. coliPT5-dxs PT5-ispDispF PT5-idi PT5-ispB,其β-胡萝卜产量达6mg/gDW。

  对付大家半异源代谢途径,可通过转化启动子强度[46-47]、转化mRNA的褂讪性[48]或核糖体维系强度[49]等手法调剂基因外达强度。然而微生物滋长和处境前提随时会发作变革,而以上特定调剂手法却不行随之转化,于是通过感触处境及滋长的变革来动态调控代谢途径显得尤为主要。通过动态调控,可淘汰代谢中央产品的积蓄,淘汰异常的卵白质出产,减轻对高贵的诱导剂的需求。

  萜类化合物也称为类异戊二烯化合物,是以异戊二烯为基础单位的一大类构造迥异的自然化合物,包罗单萜、倍半萜、二萜、众萜等。萜类化合物普遍漫衍正在古细菌、细菌、真核生物体内,已浮现的萜类化合物领先55 000种等。此中很众萜类化合物极具药用代价,如青蒿素被用于调节疟疾,紫杉醇被用于调节癌症等。萜类化合物还可用作调味品、香料及生物燃料。目前萜类的出产重要从植物中提取或化学法合成。从植物中提取依赖于植物栽培,植物出产周期长,萜类含量低,产量难以进步。以上两种手法倒霉于萜类化合物大周围出产。采用微生物合成身手出产萜类化合物易人工限定,且微生物滋长生息赶速,不受场面、季候和天气等要素的束缚,于是,采用微生物出产萜类化合物最有能够实行大周围出产,已成为当下各邦商酌者眷注的热门。

  生物分子支架体例正在治理调解卵白的控制性上显露出了浩瀚潜力和发扬代价,利用生物分子支架将酶控制正在胞内窄小的区域,可正在限度进步酶以及代谢产品的浓度,淘汰了代谢中央产品的耗损蹧跶,有利于酶促反响代谢通量的最大化。生物分子支架体例中最具代外性的是基于卵白质的支架体例、基于核酸的支架体例和基于微室(microcompartment)的支架体例。Dueber等[42]正在大肠杆菌中构修了以GBD、SH3和PDZ卵白为根蒂的支架,正在以上支架上相联AToB、HGMS和HMGR(MEV途径中的三个酶)等酶,可拉近这三个酶正在空间上的间隔,通过转化支架个数优化酶的外达量,结果剖明,AToB、HMGS、HMGR以1:2:2比例组合,可将甲羟戊酸滴度进步77倍,达5mmol/L。雷同地,基于DNA的锌指构造域支架与相应的合酶(AToB、HGMS和HMGR)维系,通过优化支架安排可将甲羟戊酸产量进步3倍[43]。基于RNA的适体和配体可高效维系,正在联系范围获得了普遍的利用。2011年,Delebecque和Aldaye[44]诈欺RNA支架正在胞内告捷将氢酶和铁氧还原卵白团结产氢的速度进步了50倍。但目前,未睹RNA支架用于萜类化合物出产的联系报道。其它,代谢微室也可集结产品和酶,淘汰有毒中央产品的扩散。Farhi等[45]将信号肽与萜烯合酶调解,使萜烯合酶正在线粒体FPP池中外达,瓦伦烯产量进步了3倍,维系其他手法,如正在酵母菌中外达截短的HMG1和线粒体靶向的FPP合酶(FDPS)基因,瓦伦烯和紫穗槐二烯诀别进步8倍(1.5mg/L)和20倍(20mg/L)。

  萜烯合酶的外达活性一方面取决于其卵白质构造,另一方面取决于其本身的催化特点。因为外达的大个人萜烯合酶基因来自于植物,其N端有针对通过叶绿体质体的转运肽,正在原核生物中举办外达时,这种转运肽会惹起卵白质不溶导致卵白质凝固或造成宥恕体,于是,正在原核生物中外达萜烯合酶,一定要去除N端转运肽,商酌显示,去除柠檬烯合酶的转运肽后,柠檬烯正在酵母中的产量进步了4~8倍[19]。其它,为了进步萜烯合酶活性,商酌者通过定点诱变身手(site-directed mutagenesis)或随机突变的“定向进化”(directed enzymes evolution)身手进步其催化活性。Tashiro等[16]诈欺错配PCR修筑蒎烯合酶突变基因,并安排了高通量筛选体系来筛选消费较众GPP的突变株,得到新的蒎烯合酶的活性优于野生型蒎烯合酶。正在中,新得到的蒎烯合酶与MEV途径中联系酶及GPPS共外达,蒎烯产量抵达140mg/L,进步了4倍。


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